Mezenchymalne komórki macierzyste świni, ich charakterystyka oraz wykorzystanie w pozaustrojowym uzyskiwaniu zarodków bydlęcych i klonowaniu somatycznym świni

Mezenchymalne komórki macierzyste świni, ich charakterystyka oraz wykorzystanie w pozaustrojowym uzyskiwaniu zarodków bydlęcych i klonowaniu somatycznym świni

  • Kierownik projektu: dr inż. Jolanta Opiela, Instytut Zootechniki w Krakowie
  • Tytuł projektu: Mezenchymalne komórki macierzyste świni, ich charakterystyka oraz wykorzystanie w pozaustrojowym uzyskiwaniu zarodków bydlęcych i klonowaniu somatycznym świni
  • Konkurs: SONATA 2, ogłoszony 15 września 2011 r.
  • Panel: NZ9
Mezenchymalne komórki macierzyste świni w hodowli in vitro

Mezenchymalne komórki macierzyste świni w hodowli in vitro

Wydajność kompleksowej metody pozaustrojowej produkcji zarodków, w tym zapłodnienia in vitro u bydła, a także klonowania somatycznego świń od kilku lat pozostaje na stałym, stosunkowo niskim poziomie i z reguły nie przekracza, odpowiednio, średniej wartości 30% oraz 15%. Wydaje się, że zaproponowany w niniejszym projekcie kierunek badań, polegający na użyciu w obu procedurach mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC; ang. mesenchymal stem cells) szpiku kostnego, z uwagi na ich właściwości i multipotencjalny[*] charakter, czynnościowo bardziej zbliżony do statusu komórek zarodkowych może przyczynić się do przełamania impasu w efektywności zapłodnienia in vitro bydła oraz klonowania świń. Wśród hodowanych in vitro, wyizolowanych ze szpiku kostnego komórek nie wszystkie wykazują zdolności do różnicowania się. Dlatego konieczna jest szczegółowa charakterystyka tych komórek, która pozwoli określić ich odsetek oraz jakość. Stopień ich multipotencji, a także zróżnicowania może być ważnym parametrem wpływającym zarówno na efektywność hodowli zarodków uzyskiwanych w wyniku zapłodnienia in vitro, jak i efektywność klonowania somatycznego.

Projekt ma kilka głównych celów. Pierwszym jest charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego świni (ang. porcine bone marrow derived mesenchymal stem cells, pBM-MSC), które zostaną poddane modulacji epigenetycznej (pozagenowej), aby sprawdzić, czy ma ona wpływ na zachowanie multipotencji i na jakość komórek macierzystych. Drugim celem jest zbadanie, czy związki i czynniki wydzielane przez MSC do pożywki hodowlanej mogą istotnie polepszyć i zoptymalizować rozwój zarodków bydlęcych in vitro. Z kolei, wykorzystując jądra mezenchymalnych komórek macierzystych w procedurze klonowania somatycznego, a także międzygatunkowego chcemy sprawdzić, czy ich zdolności do różnicowania się, jak również zastosowane na tych komórkach modulacje umożliwią efektywniejsze przeprogramowanie jądra w trakcie klonowania somatycznego niż w przypadku zwykle stosowanego jądra komórki somatycznej. Dotychczasowe prace badawcze nad klonowaniem międzygatunkowym z wykorzystaniem komórek bydlęcych oraz świni nie kończyły się powodzeniem, ponieważ rozwój zarodka zatrzymywał się zawsze na tym samym etapie (stadium 8-16). Pokonanie tej bariery przy zastosowaniu oocytu bydlęcego, do którego zostanie wprowadzone jądro komórki mezenchymalnej świni byłoby wyraźnym potwierdzeniem postawionej hipotezy badawczej.

Trzy blastocysty bydlęce po reakcji TUNEL wykonanej w celu oceny jakości zarodków uzyskanych w wyniku zapłodnienia in vitro - na niebiesko wybarwione zostały wszystkie jądra komórkowe zarodka natomiast na zielono jądra komórek blastocysty które uległy fragmentacji DNA

Trzy blastocysty bydlęce po reakcji TUNEL wykonanej w celu oceny jakości zarodków uzyskanych w wyniku zapłodnienia in vitro - na niebiesko wybarwione zostały wszystkie jądra komórkowe zarodka natomiast na zielono jądra komórek blastocysty które uległy fragmentacji DNA

Adekwatnie do postawionych celów, projekt składa się z czterech głównych zadań badawczych: 1) Wyprowadzenie i hodowla in vitro linii MSC, ich charakterystyka oraz ocena jakościowa; 2) Pozaustrojowe uzyskiwanie zarodków bydlęcych i ich hodowla w pożywkach przygotowanych z wykorzystaniem aktywności wydzielniczej MSC; 3) Wewnątrzgatunkowe klonowanie somatyczne świń z wykorzystaniem jako dawców jąder pBM-MSC poddanych modulowaniu epigenetycznemu; 4) Międzygatunkowe klonowanie somatyczne.

Przypuszcza się, że wykorzystanie jako dawców jąder niezróżnicowanych MSC szpiku kostnego, które charakteryzują się wysoką zdolnością do różnicowania się oraz znaczną plastycznością genomową/epigenomową, umożliwi zwiększenie szansy na rozwój zarodków klonalnych świni. Sztuczna modulacja hodowanych in vitro mezenchymalnych komórek macierzystych może dodatkowo ułatwić proces przeprogramowania genomu jądrowego tych komórek w zarodkach klonalnych świni. W dostępnej literaturze nie ma jeszcze danych na temat oceny wpływu modulacji pozagenowej na mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego oraz na potencjał rozwojowy zarodków uzyskiwanych metodą wewnątrz- i międzygatunkowego klonowania somatycznego.


Dr inż. Jolanta Opiela

Absolwentka Uniwersytetu Rolniczego im. Hugona Kołłątaja w Krakowie (Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt). Od października 2001 była zatrudniona w Instytucie Fizyki Jądrowej. Od 2002 roku związana z Instytutem Zootechniki Państwowym Instytutem Badawczym w Balicach (IZ – PIB), gdzie w 2007 roku z wyróżnieniem obroniła rozprawę doktorską. Obecnie jest zatrudniona na stanowisku adiunkta w Dziale Biotechnologii Rozrodu Zwierząt IZ-PIB. Podczas swojej pracy naukowej brała udział w realizacji kilku projektów (w tym również jako kierownik) związanych z optymalizacją procedury pozaustrojowego uzyskiwania zarodków bydła i kóz (IVM, IVF, IVC), a obecnie sferę swoich zainteresowań badawczych poszerzyła o mezenchymalne komórki macierzyste i ich praktyczne zastosowanie w medycynie regeneracyjnej oraz biotechnologii rozrodu zwierząt.


[*] Multipotencja to zdolność komórek niezróżnicowanych do przekształcenia się we wszystkie typy komórek w obrębie danego listka zarodkowego: ektodermy, mezodermy lub endodermy; np. w obrębie mezodermy mogą dać początek np. komórkom szpiku, krwi lub mięśni