Poszukiwanie związków przeciwbakteryjnych o podwójnym mechanizmie działania

Jednym z największych zagrożeń dla zdrowia publicznego jest nasilające się zjawisko oporności na działanie skutecznych dotąd, powszechnie stosowanych leków przeciwbakteryjnych. Drobnoustroje oporne na antybiotyki spotykamy zarówno w środowisku kształtowanym antropogenicznie, jak i w szpitalach. Do przyczyn rosnącej antybiotykooporności zaliczyć można: nieuzasadnione przepisywanie antybiotyków przez lekarzy, podawanie leków o szerokim spektrum działania bez uprzedniego wykonania antybiogramów, błędy pacjentów (samoleczenie, nadmierna i niepotrzebna konsumpcja, jak również odstawienie antybiotyku po ustąpieniu objawów przed ukończeniem kuracji) oraz stosowanie antybiotyków niezgodnie z przeznaczeniem w weterynarii (w celach profilaktycznych zamiast terapeutycznych) i rolnictwie (do przyspieszonego wzrostu zwierząt hodowlanych). Aby przeciwdziałać rozwojowi antybiotykoodporności podejmowanych jest wiele strategii, m.in. opracowywanie leków hybrydowych. Substancje te posiadają w swojej cząsteczce różne biologicznie czynne fragmenty aktywne wobec innych celów molekularnych. Podejście to jest niezwykle korzystne nie tylko ze względu na niższe prawdopodobieństwo wykształcenia przez bakterie mechanizmów obronnych wobec wielu fragmentów farmakoforowych, ale także przez możliwość równoważenia skutków ubocznych jednej części hybrydy przez inną.

fot. Michał Łepecki Głównym celem projektu badawczego było zaprojektowanie biblioteki nowej klasy związków przeciwbakteryjnych wykazujących unikatowy, podwójny mechanizm działania obejmujący hamowanie bakteryjnych enzymów niezbędnych w replikacji DNA, topoizomeraz typu II, oraz zaburzenie funkcjonowania lipidowych błon komórek bakterii chorobotwórczych.

W wyniku badań otrzymano 16 nowych substancji o strukturze hybrydowej łączącej szkielet jednego z leków fluorochinolonowych i fluorescencyjne ugrupowanie triazoliniowe, zawierające czwartorzędową sól amoniową, która – podobnie jak znane środki o działaniu bakteriostatycznym – posiada ładunek dodatni zlokalizowany na czwartorzędowym atomie azotu. Otrzymane związki przebadano wobec panelu Gram-dodatnich i ujemnych szczepów patogenów ludzkich.

fot. Michał Łepecki Wyniki eksperymentów dowiodły, że badane substancje powodują redukcję liczby komórek bakteryjnych, zmiany w ich morfologii i zaburzenia w podziale komórkowym. Minimalne stężenia hamujące rozwój drobnoustrojów wyznaczone dla najbardziej aktywnych związków znajdowały się w niskim, mikromolowym zakresie i były porównywalne do leków stosowanych w praktyce klinicznej. Na podstawie testów biochemicznych dowiedziono, że otrzymane pochodne są silnymi inhibitorami enzymu gyrazy DNA bakterii Escherichia coli i wykazują zdolność do permeabilizacji błon bakteryjnych. Najbardziej aktywne hybrydy, pochodne cyprofloksacyny, enoksacyny i lomefloksacyny, przejawiały zdolność usuwania zwartych, trudnych do zwalczenia struktur biofilmu bakteryjnego szczepów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, które wywołują odpowiednio oportunistyczne infekcje dróg oddechowych u pacjentów chorych na mukowiscydozę oraz ropne zapalenia skóry, tkanek podskórnych i miękkich. Wybrane szczepy bakterii wykazały opóźnione narastanie oporności wobec pochodnych enoksacyny i gatyfloksacyny w porównaniu z lekami macierzystymi. Ponadto, wszystkie otrzymane związki cechował brak toksyczności wobec ludzkiej linii komórkowej HEK-293 (nerka embrionu ludzkiego). Przeprowadzono także eksperymenty dokowania molekularnego, aby zracjonalizować obserwowaną aktywność przeciwbakteryjną. Nowe koniugaty wykazały zdolność wiązania w miejscach aktywnych gyrazy DNA Staphylococcus aureus i topoizomerazy IV Streptococcus pneumoniae w sposób charakterystyczny dla fluorochinolonów. Na podstawie eksperymentów chromatograficznych wykazano związek pomiędzy lipofilowością i aktywnością biologiczną otrzymanych związków hybrydowych.Przeprowadzone badania umożliwiły wyselekcjonowanie związków o najkorzystniejszym profilu działania bakteriobójczego do dalszych badań przedklinicznych. Dodatkowo potwierdzone właściwości fluorescencyjne nowych związków hybrydowych pozwalają na monitorowanie losów molekuł w komórkach.