Nowe rozwiązania analityczne w onkologii

Oponiaki i glejaki są jednymi z najczęściej spotykanych nowotworów mózgu. W Polsce odnotowuje się większą niż w całej Europie zapadalność na te typy nowotworów. Mimo wysokiego odsetka zachorowań ich etiopatogeneza nie jest do końca znana, a złożoność histologiczna tkanki mózgowej, z której powstają wspomniane nowotwory, a zwłaszcza glejaki, utrudnia niejednokrotnie precyzyjną klasyfikację guza. Stosowane testy diagnostyczne oparte są głównie na metodach obrazowania tj. magnetyczny rezonans jądrowy, tomografia komputerowa czy pozytonowa tomografia emisyjna. Niewątpliwą zaletą ww. metod jest ich bezinwazyjność oraz możliwość precyzyjnej lokalizacji nowotworu, jednak nie dają one informacji o składzie biochemicznym danej tkanki nowotworowej oraz reakcjach w niej zachodzących. Bezpośrednich analiz tkanki dokonuje się naturalnie w momencie dostępu do materiału biologicznego, czyli w przypadku guzów mózgu, dopiero podczas i po operacji. Rutynową procedurą jest wykonanie badań histopatologicznych usuniętego guza, co pozwala na jego klasyfikację pod kątem rodzaju i stopnia złośliwości. Niestety, ocena histopatologiczna jest subiektywna i zależy w znacznej mierze od doświadczenia prowadzącego badanie, dlatego w przypadkach niejednoznacznych konieczne jest uzyskanie oceny referencyjnej, co wydłuża czas oczekiwania na wynik. To z kolei działa na niekorzyść pacjenta, gdyż jak najszybsze wdrożenie odpowiedniego leczenia zwiększa szansę jego powodzenia. Mimo oczywistych zalet badań histologicznych stosowanych przez lata w onkologii klinicyści sięgają po nowe rozwiązania, które wnoszą informacje istotne do podjęcia decyzji o strategii terapeutycznej. Przykładem takich analiz jest genotypowanie glejaków, pozwalające na wykazanie konkretnych mutacji, co znacznie lepiej koreluje z odpowiedzią na chemioterapię niż charakterystyka histopatologiczna. Genotypowanie jest jednak również stosunkowo czasochłonne a przede wszystkim kosztowne, przez co niedostępne dla wszystkich pacjentów.

Ostatnie parę lat badań w zakresie onkologii pokazuje bardzo efektywne wykorzystanie tzw. metod „omics” (proteomiki, genomiki, transkryptomiki, metabolomiki i lipidomiki) do profilowania danego nowotworu na poziomie genów, białek czy substancji o małej masie cząsteczkowej w celu znalezienia bardzo specyficznych markerów danego nowotworu oraz wskazanie mechanizmów jego powstawania i rozwoju, w tym mechanizmów powstawania lekoopornoci. Wszystkie te metody wykonywane tradycyjnymi technikami wymagają jednak poboru fragmentu tkanki nowotworowej, a następnie jej wielogodzinnej obróbki, co uniemożliwia ich wykorzystanie do analiz śródoperacyjnych.

W naszym projekcie, staramy się zaadresować potrzeby diagnostyki onkologicznej wprowadzając do badań nowoczesne technologie umożliwiające uzyskanie informacji o biochemii tkanki na poziomie związków małocząsteczkowych bez konieczności poboru materiału oraz skracające czas analiz do kilku minut. Podstawowym narzędziem analitycznym wykorzystywanym w projekcie jest technologia zwana mikroekstrakcją do fazy stałej (ang. solid phase microextraction, SPME), a aparaturą używaną do detekcji - spektrometr mas (ang. mass spectrometer, MS). Metoda ta opiera się na wprowadzeniu do badanej tkanki mikrosondy, której koniec pokryty jest biokompatybilnym materiałem umożliwiającym absorbcję związków o masie cząsteczkowej do ok. 1500 Da. Dzięki specyficznym właściwościom, uzyskuje się reprezentacyjny dla danego nowotworu „zestaw” metabolitów o różnorodnych właściwościach fizykochemicznych (profil metaboliczny). Na podstawie porównania statystycznego takiego profilu metabolicznego pozyskanego od wielu pacjentów z histologicznie stwierdzonymi konkretnymi rodzajami nowotworu (w przypadku opisanego projektu oponiaków i glejaków) możliwe jest zaproponowanie panelu potencjalnych biomarkerów charakterystycznych dla biochemicznego rodzaju nowotworu. Zaletą profilu metabolicznego jest fakt, iż odzwierciedla on zmiany wynikające zarówno z rodzaju tkanki, z której wywodzi się dany nowotwór, jak również zmiany które zostały spowodowane mutacjami genetycznymi czy środowiskowymi. Związki małocząsteczkowe, czyli metabolity, są bowiem w dużym skrócie końcowym produktem reakcji w których biorą udział białka będące z kolei efektem transkrypcji i translacji genów. Co ważne, profilowanie metaboliczne umożliwia obserwację zmian zachodzących w danej tkance w przeciągu minut, w przeciwieństwie do analizy genów i białek, których zmiany uwidaczniają się w dłuższym przedziale czasu. Ponieważ w efekcie wykorzystania mikrosondy nie pobieramy tkanek unikamy w ten sposób konieczności późniejszego wyizolowania związków z materiału biologicznego, co przy zastosowaniu standardowych metod stanowi najbardziej czasochłonny etap procesu analitycznego. W kolejnym kroku związki zaabsorbowane na mikrosondzie zostają wprowadzone bezpośrednio do spektrometru mas dzięki zastosowaniu specjalnie skonstruowanego przez naszych partnerów z University of Waterloo w Kanadzie pod kierunkiem prof. Janusza Pawliszyna interfejsu, co pozwala skrócić czas analizy wyselekcjonowanych biomarkerów do ok. 2 min.

Kolejnym elementem proponowanym w projekcie jest uzyskanie rozdzielczości przestrzennej, czyli stworzenie swoistej mapy znalezionych biomarkerów w usuniętym fragmencie guza dzięki połączeniu ekstrakcji metabolitów z użyciem mikroekstrakcji do fazy stałej i ich analizie z wykorzystaniem DESI (ang. Desorption ElectroSpray Ionization), będącej jedną z metod obrazowania MS. W tej części projektu oprócz naukowców z University of Waterloo współpracujemy również z prof. Zoltanem Takats z Imperial College London, jednym z wynalazców DESI.

W celu umożliwienia zastosowania metody również do badań przesiewowych konieczne jest dostosowanie metody do analizy próbek łatwo dostępnych, choć oczywiście mniej reprezentacyjnych/specyficznych niż tkanka nowotworowa. W naszym projekcie proponujemy opracowanie metody analizy potencjalnych biomarkerów glejaków i oponiaków we krwi. Metoda zakłada wykorzystanie systemu do równoczesnej analizy 96 próbek biorąc pod uwagę zwiększenie efektywności pracy podczas screeningu dużej ilości pacjentów w laboratoriach diagnostycznych. Starając się również zmniejszyć inwazyjność badań przesiewowych dążymy m.in. do minimalizowania objętości krwi potrzebnej do wykonania analiz do 10-20 mikrolitrów, co pozwoli na pobór przez nakłucie opuszka palca.

Nasze doświadczenie w zakresie nowoczesnych metod mikroekstrakcyjnych oraz analiz z wykorzystaniem spektrometrii mas opiera się na kilkuletniej pracy kierownika projektu, dr hab. Barbary Bojko w laboratorium prof. Janusza Pawliszyna - jednego z wiodących światowych analityków i wynalazcy wspomnianej technologii SPME - oraz kontynuowaniu tej współpracy po stworzeniu niezależnego zespołu badawczego w Polsce. Realizacja projektu, w którym konieczne jest nie tylko zapewnienie dostępu do setek pacjentów zakwalifikowanych do leczenia operacyjnego, ale także otwartość na nowatorskie metody, jest możliwa dzięki zaangażowaniu zespołu klinicystów i pielęgniarek z 10 Szpitala Wojskowego z Polikliniką w Bydgoszczy pod kierunkiem prof. Marka Harata.

dr hab. n. farm. Barbara Bojko

Jest Kierownikiem Katedry Farmakodynamiki i Farmakologii Molekularnej Wydziału Farmaceutycznego Collegium Medicum w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. W 2001 r. ukończyła studia na Wydziale Farmaceutycznym Śląskiego Uniwersytetu Medycznego uzyskując z wyróżnieniem dyplom magistra diagnostyki laboratoryjnej. W tym samym roku podjęła pracę jako asystent na wspomnianym Wydziale, gdzie po czterech latach uzyskała stopień naukowy doktora nauk farmaceutycznych w specjalności biochemia farmaceutyczna, a za swoją pracę doktorską otrzymała Nagrodę Rektora ŚUM. Przez kolejne sześć lat pracowała jako adiunkt w Katedrze i Zakładzie Farmacji Fizycznej Wydziału Farmaceutycznego ŚUM, skąd w 2008 r. wyjechała na staż podoktorancki do laboratorium prof. Janusza Pawliszyna do University of Waterloo w Kanadzie, gdzie przez pierwsze 3 lata pracowała jako Postdoctoral Follow, a kolejne 4 lata jako Research Associate. W roku 2014 otrzymała tytuł doktora habilitowanego nauk farmaceutycznych w specjalności chemia analityczna. Po powrocie do Polski podjęła się organizacji nowoczesnego zespołu pracowni obejmującego laboratorium mikroekstrakcji i spektrometrii mas, pracownię hodowli komórkowych oraz zwierzętarnię na Wydziale Farmaceutycznym CM UMK we współpracy z klinikami oraz sektorem gospodarczym, co pozwoliło rozpocząć badania wprowadzania nowoczesnych technologii do medycyny translacyjnej.

Data publikacji: 06.11.2017