Oddziaływania U6 snRNA w centrum katalitycznym spliceosomu

Splicing pre-mRNA jest jednym z podstawowych procesów niezbędnych dla prawidłowej ekspresji genów w komórkach eukariotycznych. Choć sam splicing jest prostą reakcją transestryfikacji, to katalizowany jest przez niezwykle skomplikowany enzym – spliceosom – składający się z pięciu cząsteczek RNA (tzw. snRNA) i kilkuset białek. Struktura snRNA i białek tworzących centrum katalityczne spliceosomu sugeruje, że najprawdopodobniej pochodzi on od cząstek retroelementów w pierwotnych komórkach, z których w toku ewolucji powstały dzisiejsze eukarionty. Takie pochodzenie spliceosomu częściowo tłumaczy jego niezwykle skomplikowaną i wysoce zakonserwowaną budowę. Nasze badania nad funkcjonowaniem spliceosomu prowadzimy na drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Ze względu na wysoce rozwinięte metody genetyczne i względną prostotę, organizm ten stanowi doskonały system modelowy do badania wielu podstawowych procesów biologicznych wspólnych dla wszystkich eukariontów.

Substratem reakcji splicingu jest prekursorowy mRNA, który składa się z sekwencji kodujących (egzonów) przedzielonych sekwencjami niekodującymi (intronami). Splicing polega na scaleniu wszystkich egzonów poprzez usunięcie intronów i obejmuje dwie następujące po sobie reakcje, tzw. pierwszy i drugi etap. Oba etapy reakcji wymagają odpowiednich zmian w strukturze spliceosomu, który ulega dynamicznym przekształceniom modulującym jego funkcje; np. stabilizacja konformacji dogodnej dla drugiego etapu splicingu hamuje pierwszy etap reakcji.

Aby lepiej zrozumieć funkcjonowanie spliceosomu, badamy substraty, które słabo przechodzą przez dany etap splicingu, a następnie szukamy sposobów na poprawę obserwowanego defektu. Na przykład, badając introny z mutacją G5A, które mają trudności zarówno w tworzeniu spliceosomów, jak i w przejściu przez pierwszy etap reakcji, dowiedzieliśmy się, że wprowadzenie sekwencji bogatej w cytozyny w egzonie poprzedzającym taki zmutowany intron znacznie poprawia powstawanie spliceosomów i pierwszy etap reakcji, czyli defekt mutacji G5A jest złagodzony. Co ciekawe, podobne motywy sekwencyjne są znane z komórek ludzkich, gdzie oddziałują z klasą białek SR, wspomagając powstawanie spliceosomu (ang. splicing enhancers), ale jak dotąd nikt ich nie zidentyfikował u drożdży.

Celem projektu finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki w konkursie MAESTRO jest sprawdzenie sformułowanej przez nasz zespół badawczy hipotezy o tym, że egzony zawierające motywy bogate w cytozyny współzawodniczą z U6 snRNA, wspomagając zmianę konformacji kompleksu niezbędną do zajścia katalizy. Chcemy tym samym poznać oddziaływania między U6 snRNA i białkami spliceosomu, które modulują zmiany konformacyjne kompleksu. Ponadto interesuje nas rola sekwencji egzonowych pre-mRNA w modulacji tych oddziaływań, a więc ich wpływ na zmiany konformacyjne spliceosomu. Jesteśmy w trakcie badania oddziaływań pomiędzy U6 snRNA i Cwc2– białkiem, które wpływa na zmiany konformacyjne spliceosomu na etapie katalizy. Wstępne wyniki potwierdzają naszą hipotezę; mutacje, a nawet delecje w obrębie białka Cwc2 destabilizujące wiązanie U6 snRNA, korygują defekty mutantów prp16, ATP-azy wspomagającej wyjście z pierwszego etapu katalizy, a więc destabilizują konformację kompleksu niezbędną do zajścia katalizy. Mamy nadzieję, że nasze badania doprowadzą nie tylko do lepszego zrozumienia funkcjonowania spliceosomu w drożdżach, ale też pozwolą na głębsze zrozumienie regulacji alternatywnego splicingu, procesu o wielkim znaczeniu dla ekspresji genów u człowieka.

prof. dr hab. Magda Konarska

W latach 1979-83 odbyła studia doktoranckie w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN. Rozprawę doktorską na temat mechanizmu ligacji RNA u eukariontów przygotowała pod kierunkiem prof. Witolda Filipowicza. Następnie wyjechała na staż podoktorski do Massachusetts Institute of Technology (1984-89, Center for Cancer Research w Cambridge, MA, USA), gdzie rozpoczęła pracę w laboratorium prof. Phillipa A. Sharpa, który w 1993 r. zdobył nagrodę Nobla za odkrycie splicingu pre-mRNA. W laboratorium prof. Konarska zajęła się badaniami nad mechanizmem splicingu, które kontynuuje do chwili obecnej. W 1989 r. rozpoczęła pracę we własnym laboratorium na Uniwersytecie Rockefellera w Nowym Jorku, gdzie w 2000 r. uzyskała stanowisko Professor, a w 2009 r. Evelyn Gruss-Lipper Professor. W 2000 r. otrzymała tytuł doktora habilitowanego w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN. Po ponad trzydziestu latach w USA, w 2015 r. powróciła do Polski i obecnie kieruje Laboratorium Biologii RNA w Centrum Nowych Technologii w Warszawie.

Data publikacji: 23.03.2016